標題：Single-Cell?Analyses?Identify?Brain?Mural?Cells?Expressing?CD19?as?Potential?Off-Tumor?Targets?for?CAR-T?Immunotherapies

期刊：?Cell

影響因子：36.13

導讀

CD19 導向的免疫療法在臨床上對治療 B 細胞惡性腫瘤有效，但也會引起高發生率的神經毒性。使用嵌合抗原受體（CAR)?T 細胞或雙特異性 T 細胞受體（BiTE) 抗體治療的患者部分伴有嚴重的神經毒性，包括與 T 細胞滲入大腦致命的腦水腫。在這里，作者報道了包圍內皮細胞的壁細胞表達 CD19，它對血腦屏障的完整性至關重要。作者利用單細胞 RNA-seq 數據鑒定了 CD19 在腦壁細胞中的表達，并在蛋白水平上得到了證實。隨著壁細胞譜系的出現，大腦中 CD19 的表達在發育早期就開始了，并貫穿整個成年期的大腦區域。小鼠壁細胞顯示 CD19 表達水平較低，提示臨床前神經毒性動物模型存在局限性。本研究揭示 CD19 靶向治療中神經毒性的機制，并突出了人類單細胞圖譜在設計免疫療法中的應用。

科學問題

CD19 靶向治療中神經毒性的機制？

實驗設計

2364 人前額葉皮層細胞的 scRNA-seq 數據

實驗思路

實驗結果

單細胞 RNA 測序數據鑒定表達 CD19 的壁細胞

作者首先分析了 2364 人前額葉皮層細胞的 scRNA-seq 數據（Zhong 等人，2018 年），圖 1A)。作者將細胞聚集在一起，并確定了廣泛的群體，隨后重點分析了非神經元、非紅細胞細胞。這些細胞進一步分化為星形膠質細胞、淋巴細胞、小膠質細胞、少突膠質細胞前體、內皮細胞和周細胞（圖 1B、1C 和 S1A)。根據表達標記基因對這些群體進行了鑒定；壁細胞特異表達預期的標記基因，如 PDGFRB、FOXF2、RGS5 和 CD248，而內皮細胞表達一組獨特的標記基因，包括 CDH5 和 PECAM1?(CD31; 圖 1 ?d)。另外，發現一小群表達 CD19 的壁細胞（共同表達 CD248）。

▲圖 1

兩個獨立數據集對壁細胞 CD19 表達的確認

接下來，作者試圖在額外的獨立 scRNA-seq 數據集中重現這一觀察結果。在來自人類前腦的數據集（La?Manno?et?al.，2018) 中，標記 CD248 和 RGS5 陽性的壁細胞群（48/7906 細胞）也顯示 CD19 表達（12/48 細胞有可測量的 CD19)，B 細胞標記 CD79A 缺失（圖 2A)。在來自人類前腦腹側（La?Manno?et?al.，2016) 的第三個數據集中，作者再次觀察到 CD248 陽性壁細胞群體中 CD19 的表達（195 個壁細胞 /1977 細胞，其中 25/195 有可測量的 CD19; 圖 2 ?b).

▲圖 2

人腦 CD19 的免疫組化

為了評估人類壁細胞中 CD19 蛋白的表達，作者使用臨床驗證的抗人 CD19 抗體（克隆 BT51E) 對健康死亡受試者的樣本進行了人類大腦幾個區域的免疫組化。研究發現 CD19+ 壁細胞的頻率可能存在異質性，這可以解釋臨床觀察到的神經毒性在患者之間的嚴重程度差異（圖 3）。

▲圖 3

周細胞和 vSMCs 分析顯示 CD19 在壁細胞中表達。

通過分析周細胞和 vSMCs 的轉錄組，分析顯示，CD19 高度表達的神經與血管的 meta-cell 集群，符合作者之前的結果（圖 4 ?c?D)。作者能夠清楚地區分未分化的祖細胞和分化的壁細胞，這表明一旦壁細胞出現，它們就會表達 CD19(圖 4E?F)。

▲圖 4

CD19 在周細胞和 vSMCs 中都有表達

作者使用來自 BICCN 數據集的細胞重復了這個分析，對非神經元亞群（壁細胞、內皮細胞和小膠質細胞）進行重新分析和聚類，以區分 NVU 細胞類型的轉錄差異（圖 5A?B)。作者觀察到這些細胞顯示出強富集的周細胞標志物，如 ABCC9 和 KCNJ8，不富集 ACTA2 或其他 vSMC 標記基因，表明它們代表真實的周細胞（圖 5C)。另外發現 CD19 也在 vSMC 群體中表達。這表明 CD19 的表達并非周細胞所特有，而是人類大腦壁細胞的共同特征，與 IHC 觀察到的染色模式一致（圖 3)。

▲圖 5

CAR- T 細胞識別的 CD19 亞型在成人人腦中表達

為了探究周細胞中的 CD19 表達是否也存在于成人樣本中，作者使用了 Allen?Institute?Brainspan?Project 生成的橫跨人類年齡和大腦區域的 ?RNA 測序數據。作者首先確認了 CD19 在產前和產后樣本中表達水平相似，并且在不同腦區樣本中也有表達（圖 6A)。分析發現 CD19 在成人大腦中的表達主要是壁細胞豐度的結果，而不是 B 細胞豐度的結果。

▲圖 6

人腦 CD19 的壁細胞特異性表達

研究對腦周細胞、肺周細胞和 vSMCs 進行了對比分析，作者發現了大腦和肺周細胞之間的許多轉錄差異（圖 7A,?S7A)。值得注意的是，CD19 在大腦中特異表達。作者探索了定位于細胞膜或細胞表面的基因是否在相對于肺周細胞和 B 細胞的 NVU 中有差異表達，并可用于提高 CD19?CAR- T 的安全性（圖 7B?C)。

▲圖 7

參考文獻：

Parker?Kevin?R,Migliorini?Denis,Perkey?Eric?et?al.?Single-Cell?Analyses?Identify?Brain?Mural?Cells?Expressing?CD19?as?Potential?Off-Tumor?Targets?for?CAR-T?Immunotherapies.[J]?.Cell,?2020,?183:?126-142.e17.