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1、SMART-seq
2012 年，由美國和瑞典的科學家共同開發了稱為 Smart-Seq（Switching mechanism at 5’end of the RNA transcript）的技術 [1]。在 2013 年，Nature Methods 雜志上報告了新的方案，被稱為 Smart-Seq2[2]，隨后在 2014 年他們有公布了詳細的操作流程 [3]。獲取單細胞并裂解細胞后，含有 oligo-dT 的引物與 mRNA 的 poly- A 結合，逆轉錄酶 MMLV 進行逆轉錄，逆轉錄酶到達 mRNA 5’末端時，MMLV 的末端轉移酶活性會在一鏈 cDNA 的 3'末端增加額外的胞嘧啶，這時 TSO 引物 3' 末端的 rGrG+ G 結合到首鏈末端的胞嘧啶，然后以首鏈 cDNA 為模版進行延伸合成互補的第二鏈，全長 cDNA 經過 PCR 擴增后進一步進行測序文庫的構建。
▲SMART-seq2 技術原理
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1、起始量低：1 個細胞起始，適用于難以滿足 10X Genomics 等平臺起始細胞量要求的樣本。
2、覆蓋度高： 測序覆蓋 cDNA 的全長序列，每個細胞能夠獲得上萬個基因的表達。
3、信息個性化： 除了獲得基因表達信息，數據能夠用于可變剪接，cSNP 等分析，以及帶 poly- A 結構的 lncRNA 研究。
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文庫結構
圖 SMART-seq2 文庫示意圖
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建議測序深度及參數
指標 | 參數 |
測序深度 | 6Gb/cell |
測序類型 | PE150 |
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1、類型：新鮮組織，原代細胞，細胞系等。
2、來源：血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。
3、樣本量：單個細胞（或微量細胞）。
4、保存運輸：細胞放入 SMART-seq 試劑盒指定的裂解液中，-80°C 保存，干冰運輸。
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2、10X Genomics
10X Genomics 公司的 Chromium 系統利用 8 通道的微流體“雙十字”交叉系統，將含 barcode 的凝膠珠（Gel Beads）、細胞和酶的混合物、油三者混合，形成 GEMs（油包水的微體系）。GEMs 形成后，細胞裂解，凝膠珠自動溶解釋放大量 barcode 序列，隨后 mRNA 逆轉錄產生帶有 10X barcode 和 UMI 信息的 cDNA，構建標準測序文庫，其中 10X barcode 用于區分細胞，UMI 用于區分 mRNA 分子。
圖 10X genomics 技術原理
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1、通量高： 一張芯片具有 8 個獨立的通道，可供 8 個樣本同時上機，每個通道可捕獲 10000 個細胞。
2、捕獲率高： 單細胞捕獲效率高達 65%，多細胞比例 <0.9%（1,000 個細胞中）。
3、延展性強： 除了獲得單細胞 mRNA 的信息，還提供了單細胞 TCR/BCR、單細胞表面蛋白、單細胞 ATAC 等多種解決方案。
文庫結構
圖 10X Genomics 3’gene expression 文庫示意圖
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建議測序深度及參數
指標 | 參數 |
測序深度 | 50,000~100,000 reads/cell |
測序類型 | PE150 |
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1、類型：新鮮組織，原代細胞，細胞系等。
2、來源：血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。
3、樣本量及其它質控要求：
| 樣本類型 | 樣本質控要求 |
| 細胞懸液 | >105 目標細胞個數（底限 10,000 個細胞）； |
| 活率 >80%； | |
| 濃度 500-1,000 個細胞 /ul； | |
| 細胞間無粘連（成團率 <5%）； | |
| 無大于 40μm 的細胞碎片或其他顆粒物； | |
| 不存在逆轉錄抑制劑和非細胞的核酸分子。 | |
| 血液 | EDTA 抗凝的全血（不可肝素抗凝），>5ml。 |
| 組織 | 0.3cm×0.3cm（不超過 0.5cm×0.5cm）的新鮮組織，4～5 塊。 |
4、保存運輸：
（1）細胞懸液：建議現場制備，如要運輸，建議使用伯豪生物自主研發的單細胞保護液，4°C 運輸，48 小時內送達伯豪生物實驗室。
（2）血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 運輸，2 小時內送達伯豪生物實驗室；或提取 PBMC 后凍存，干冰運輸。
（3）組織：建議使用伯豪生物自主研發的單細胞組織保護液，4°C 運輸，48 小時內送達伯豪生物實驗室。
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3、BD Rhapsody
BD Rhapsody 技術利用卡式芯片在磁性的寡核苷酸條形碼標記微球上實現單細胞捕獲和 mRNA 轉錄本的分子標簽，然后將這些微球合并到單個管中用于 cDNA 擴增和文庫構建。可滿足 100~10000 個細胞的自動分選、擴增及建庫。
圖 BD Rhapsody 技術原理
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此外，該技術使用帶有寡核苷酸的高質量抗體（Ab-oligos），這條寡核苷酸帶有抗體特異的條形碼，細胞在經過 Ab-oligos 標記后，可在單細胞水平同時獲得轉錄組和蛋白表達。
圖 單細胞 mRNA 與蛋白同時測序
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| 高 效 | 每個樣本可測 100~10000 個細胞； |
| 2 天內完成細胞懸液制備、單細胞捕獲、擴增以及建庫。 | |
| 靈 活 | 抗體標簽技術可實現多樣本混合捕獲； |
| 可選擇全轉錄組測序或目標基因測序。 | |
| 可靠 | 利用成像系統對單細胞捕獲過程進行質控； |
| 單細胞捕獲效率高達 80%，多細胞比例 <1%（1,000 個細胞中）。 | |
| 整合 | 可同時檢測單個細胞的 mRNA 水平與蛋白水平。 |
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文庫結構
圖 BD Rhapsody 基因表達文庫示意圖
建議測序深度及參數
指標 | 參數 |
測序深度 | 50,000~100,000 reads/cell |
測序類型 | PE150 |
1、類型：新鮮組織，原代細胞，細胞系等。
2、來源：血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。
3、樣本量及其它質控要求：
| 樣本類型 | 樣本質控要求 |
| 細胞懸液 | > 10* 目標細胞個數（底限 10,000 個細胞）； |
| 活率 >80%； | |
| 濃度 500-1,000 個細胞 /ul； | |
| 細胞間無粘連（成團率 <5%）； | |
| 無大于 40um 的細胞碎片或其他顆粒物； | |
| 不存在逆轉錄抑制劑和非細胞的核酸分子。 | |
| 血液 | EDTA 抗凝的全血（不可肝素抗凝），>5ml。 |
| 組織 | 0.3cm×0.3cm（不超過 0.5cm×0.5cm）的新鮮組織，4~5 塊。 |
4、保存運輸：
（1）細胞懸液：建議現場制備，如要運輸，建議使用伯豪生物自主研發的單細胞保護液，4°C 運輸，48 小時內送達伯豪生物實驗室。
（2）血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 運輸，2 小時內送達伯豪生物實驗室；或提取 PBMC 后凍存，干冰運輸。
（3）組織：建議使用伯豪生物自主研發的單細胞組織保護液，4°C 運輸，48 小時內送達伯豪生物實驗室。
圖 數據質控及過濾
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圖 去除批次效應
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圖 單細胞 RNA 測序細胞亞群注釋
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圖 單細胞 RNA 測序樣本間的細胞構成差異
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圖 單細胞 RNA 測序 Marker 基因分析
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圖 單細胞 RNA 測序擬時序分析
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圖 單細胞 RNA 測序擬時序 GO 注釋
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圖 單細胞 RNA 測序擬時序分化轉錄因子調控網絡
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圖 單細胞 RNA 測序細胞亞群的功能富集分析
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圖 單細胞 RNA 測序細胞亞群的功能富集在樣本間的差異
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圖 單細胞 RNA 測序樣本間的功能差異分析
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圖 細胞通訊網絡
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1、胚胎發育
人類胚胎發育早期僅能收集微量的胚胎細胞和干細胞，這對于了解控制胚胎發育的基因調控網絡是一個難題，利用單細胞 RNA-Seq 技術對轉錄組進行分析則克服了轉錄組分析對細胞數量要求的限制，近年來已有多篇相關報道。北京大學湯富酬教授課題組早在 2009 年就對單個小鼠卵裂球的進行 RNA-Seq[4]，檢測到了比微陣列技術多 75%（5270）的表達基因，并且確定了 1753 個新的可變剪接位點。這種單細胞 mRNA- Seq 檢測將大大提高我們對單個細胞在哺乳動物發展中轉錄復雜性的分析能力，尤其是胚胎發育早期和干細胞這類在體內罕見的細胞群。2013 年，他們又對 90 個處于不同發育階段的人類早期胚胎細胞以及 34 個胚胎干細胞進行了詳盡的分析 [5]，檢測出了 22,687 個母源表達基因，其中包括 8,701 條長鏈非編碼 RNAs，相比于以往通過 microarray 檢測出的 9,735 個母源基因數量大大增加。研究還發現了 2,733 條新的 lncRNAs，其中許多只在特定的發育階段表達。此外，實驗還檢測到 1498 個基因在上胚層（Epiblast，EPI）和體外人類胚胎干細胞間存在差異表達，證實了 EPI 和 ESCs 具有顯著不同的轉錄組，有顯示差異性表達，從而解答了人類上胚層和體外干細胞之間的基因表達是否相同這一由來已久的問題。
圖 單細胞 RNA 測序應用：早期胚胎的單細胞測序 [5]
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2、器官發育
發育是一個極其復雜的過程，器官發生涉及到多種細胞類型的協調作用，期間基因表達受到嚴密、精準的調控，這一過程中的基因表達調控機制仍然亟需深入研究。心臟是哺乳動物在胚胎期先形成的功能器官之一。盡管已有對小鼠胚胎心臟發育的大量系統研究，但是人類與小鼠的心臟存在著很大差異。2019 年，湯富酬課題組和喬杰課題組合作，利用高精度單細胞轉錄組測序技術對人類胚胎 5 周至 25 周心臟的 4000 多個單細胞進行了系統的分析 [6]。該研究系統鑒定了人類胚胎期心臟的主要細胞類型，包括心肌細胞、成纖維細胞、內皮細胞、瓣膜細胞、心外膜細胞、平滑肌細胞以及各種免疫細胞（包括肥大細胞、巨噬細胞、T 細胞和 B 細胞）。隨著心臟發育進展，心房、心室中的心肌細胞比例顯著下降，成纖維細胞、巨噬細胞等非心肌細胞的比例逐漸上升，這說明在發育過程中成纖維細胞等非心肌類型細胞對心臟發育的作用可能越來越重要。此外，還發現心肌細胞解剖位置特異性的基因表達特點，而這些特點在早至胚胎發育第 5 周時就已經有明確顯現。此外，通過與已經發表的小鼠心臟發育的單細胞轉錄組數據進行系統比較，鑒定出一系列人類心臟發育過程中主要細胞類型特異表達的重要基因。該研究還發現人類與小鼠的心臟中心肌細胞是較為相似的細胞類型，而成纖維細胞等細胞類型的物種間差異較大，這為利用小鼠模型研究人類的心臟發育提供了參比標準。
圖 單細胞 RNA 測序應用：臟發育過程中主要細胞類型的時空特征 [6]
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3、干細胞分化
造血干細胞（HSC）具有長期自我更新、分化成多種成熟血細胞的潛能。它起源于胚胎前體，包括生血內皮細胞和造血干細胞前體（pre-HSCs）。2016 年，軍事醫學科學院劉兵課題組利用 pre-HSCs 特異性的表面標志，分離出高純度的 pre-HSCs。并針對 HSC 發育過程中具有代表性的 5 類細胞進行單細胞轉錄組測序，繪制了 HSC 發育過程的轉錄組圖譜，揭示了 pre-HSC 在轉錄活性、基因表達、代謝狀態、信號通路和轉錄因子網絡等方面的特征 [7]。發現并揭示 mTOR 信號通路在特異性調控 HSC 發育中發揮了關鍵作用。此外，還發掘出 Pre-HSC 的 98 個特征基因。該研究為今后闡明 HSC 的體內發育規律、發掘 HSC 的體外再生策略提供了可靠的理論依據和數據資源。基于以上單細胞轉錄組數據，課題組在 2019 年進一步描繪出 HSC 發育全程的 lncRNA 動態表達圖譜，并鑒定到在 HSC 發育過程中重要的功能性 lncRNA 分子 [8]。本研究通過生物信息學分析篩選獲得一組潛在的功能性 lncRNA，并通過體外功能實驗發現 6 個可能在胚胎造血發育中發揮作用的 lncRNA。利用條件基因敲除研究策略，著重闡明了 lncRNA-H19 對于 AGM 區 HSC 發生的重要作用。LncRNA-H19 的缺失使得重要造血轉錄因子（包括 Runx1 及 Spi1 等）的啟動子區域高甲基化并下調其表達，以致血管內皮細胞向 pre-HSC 的轉化阻滯。
圖 單細胞 RNA 測序應用：HSC 發育過程中的基因動態圖譜 [7]
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4、神經科學
神經科學是單細胞測序的另一個應用領域，哺乳動物的大腦中有數十億個神經元，每個神經元可根據形態特征，電生理特性，分子標記進行歸類。在一群細胞中，單個神經元特異性的信息就被稀釋了，少數細胞特異的基因表達則有可能無法檢測到。研究不同神經元的表達模式能夠為我們提供更全的基因表達圖譜、甚至表達調控網絡。而且，將單個神經元的基因表達于神經元的表型信息結合起來，還能幫助我們對神經元進行更加準確和細致的分類。上海伯豪助力中國科學院上海生命科學研究院神經科學研究所張旭院士研究組，通過高覆蓋度的單細胞測序和以神經元大小為參考的層次聚類，對小鼠背根神經節初級感覺神經元進行了分類，又通過全細胞膜片鉗在體記錄結合單細胞 PCR 方法可檢測各類初級感覺神經元對外周皮膚刺激的反應。該工作通過高覆蓋的單細胞測序對初級感覺神經元進行了重新分類，并且建立了基因表達與在體功能的相互關系 [9]。
圖 單細胞 RNA 測序應用：神經元單細胞測序及亞群分類 [9]
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5、腫瘤微環境
腫瘤細胞能夠采用不同策略，使人體的免疫系統受到抑制，不能正常殺傷腫瘤細胞，上述過程被稱為免疫逃逸。免疫治療通過激活人體自身的免疫系統，恢復機體正常的抗腫瘤免疫反應，從而控制與清除腫瘤。其中抗程序性死亡蛋白 1（programmed death 1, PD-1）及其配體（PD-L1）抑制劑是目前研究較多，發展較快的一種免疫療法。在各種腫瘤中，接受 PD-1 /PD-L1 抑制劑單藥治療患者的客觀有效率也僅為 10-30%，大部分患者對免疫檢查抑制劑并不敏感。隨著研究的深入，人們逐漸了解到腫瘤微環境的復雜性和多樣性，以及它對免疫治療的重要影響。腫瘤微環境與腫瘤細胞相互作用，共同介導了腫瘤的免疫耐受，從而影響了免疫治療的效果。抗腫瘤免疫應答是由眾多免疫細胞和分子參與的復雜過程，受到機體復雜而精細的調控，這其中的機制仍有待進一步研究。2017 年 6 月，北京大學張澤民課題組及其合作在 Cell 雜志發表了肝癌 T 細胞圖譜研究 [10]，研究總共獲得 5063 個單細胞的數據，總共聚類為 11 個 T 細胞亞群，包括 5 個 CD8+ T 細胞亞群和 6 個 CD4+ T 細胞亞群。其中肝癌組織中侵潤 Tregs 細胞亞群（C8_CD4-CTLA4）和耗竭性 CD8 T 細胞亞群（C4_CD8-LAYN）顯著富集，并且在這兩類細胞中表達的 PDCD1 和 TIGIT 等，是免疫治療的靶點。在腫瘤侵潤性 Tregs 中，共鑒定出 401 個特異表達基因，在耗竭性 CD8 T 細胞中，鑒定出 82 個特異表達基因，并且發現了新的耗竭 maker，如 LAYN，PHLDA1 和 SNAP47 等。值得注意的是，其中 22 個耗竭 marker 同時也在腫瘤侵潤性 Tregs 細胞中高表達，例如 CTLA4 和 LAYN 等。并且利用 TCGA 的數據進行生存分析，發現 LAYN 的表達顯著降低生存期。本研究還在單細胞水平進行了 TCR 測序和分析，結果發現，在腫瘤侵潤的 exhausted T 細胞和 Tregs 細胞中，觀察到 TCRs 發生了重復使用。在腫瘤組織中含有相同 TCR 的 T 細胞比例較高，而在外周血和正常組織中比例較低，這說明在腫瘤中的 exhausted T 細胞和 Tregs 細胞發生了克隆擴增。并且相比于早期病人，晚期病人中 T 細胞的克隆擴增更加明 顯。本研究為腫瘤免疫的圖譜勾畫做出了范式，也為今后其他腫瘤開展類似的研究及各類腫瘤免疫的發展提供基礎。
圖 單細胞 RNA 測序應用：肝癌患者的單細胞測序 [10]
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6、用藥指導
藥物誘發的超敏綜合癥（DiHS/DRESS）是一種致命的多器官炎癥性疾病，與皰疹病毒再激活和誘發的自身免疫性疾病相關。病理生理學仍然不清楚，臨床治療的選擇有限。2020 年 1 月發表在 Nature Medicine 上研究對 DiHS/DRESS 患者的皮膚和血液進行了 scRNA-seq 檢測 [11]。皮膚活檢組織通過單細胞 RNAseq 發現，患者對比健康人差異表達基因數量較多的是淋巴細胞群體。分析皮膚活檢的淋巴細胞，發現患者淋巴細胞呈現不同的分群。患者淋巴細胞中高表達的代表性基因有 CCR10，JAK3，STAT1 等。
圖 單細胞 RNA 測序應用：患者皮膚活檢的淋巴細胞呈現不同的分群 [11]
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血液 PBMCs 細胞通過單細胞測序發現，患者對比健康人差異表達基因數量較多的是 CD4 和 CD8 陽性的亞型細胞和增殖的細胞。比較血液 PBMCs 在患者和健康人中的細胞群體分布，發現 CCR4 和 CCR10（免疫細胞皮膚歸巢趨化因子受體）高表達的 CD4 和 CD8 陽性細胞在患者中顯著高于健康人。在患者的這個細胞群體中，表達 JAK3，STAT1，IL2RG 等基因的細胞比例明 顯高于健康人。
圖 單細胞 RNA 測序應用：患者血液的 CD4 和 CD8 細胞呈現不同的分群 [11]
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給予患者 JAK 抑制劑（tofacitinib）和口服抗皰疹病毒抑制劑（valganciclovir）后，患者的癥狀得到了極大的臨床獲益。治療前后的血液 PBMCs 細胞再次經過單細胞 RNAseq 檢測發現細胞群體分布明 顯分化。體外實驗也證實 JAK 抑制劑（tofacitinib）和抗病毒藥物（Ganciclovir 和 Artesunate）能夠有效抑制藥物（SMX-TMP）誘導的 T 細胞增殖。
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7、病毒感染
2020 年 1 月，整個中國因新型冠狀病毒 2019-nCov 得了一場“感冒”。疫情一開始，武漢病毒研究所石正麗團隊就用實驗證實了血管緊張素轉化酶 2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）是新型冠狀病毒感染人體的受體基因。2020 年 1 月 26 日，上海同濟大學醫學院左為研究團隊在《bioRxiv》上發表了題為“Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCov”的文章 [12]。
該研究利用已有的數據庫，結合單細胞 RNA 測序技術中相關生信分析，對 ACE2 在人肺內單個細胞的表達情況進行了分析，共涉及 8 個樣本，43134 個細胞。結果表明：ACE2 受體主要在一部分（1% 左右）II 型肺泡上皮細胞（AT2）中表達；同時發現這些 AT2 細胞除了表達病毒受體，還表達與病毒復制和傳播相關的基因，說明其很可能是冠狀病毒的靶細胞。可見，單細胞測序技術不僅是科研的利器，同時還為破解疫情做了應有的貢獻。
圖 單細胞 RNA 測序應用：ACE2 和其它 marker 基因在細胞亞群中的表達 [12]
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[2] Picelli S, Bj?rklund ?K, Faridani OR, et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods 2013, 10(11):1096-8.
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[4] Tang F, Barbacioru C, Wang Y, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods 2009, 6(5):377-382.
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[6] Cui Y, Zheng Y, Liu X, et al. Single-Cell Transcriptome Analysis Maps the Developmental Track of the Human Heart. Cell Rep 2019, 26(7):1934-1950.e5.
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